收樣前請(qǐng)注意 注意事項(xiàng) 1/放線菌酮：處理細(xì)胞的胰酶與PBS中盡量也加放線菌酮。 2/建議用尖底的凍存管，便于離心收集沉淀。 3/建議液氮速凍時(shí)間5min以上,再轉(zhuǎn)移到-80冰箱。 4/為確保實(shí)驗(yàn)的順利，強(qiáng)烈建議同一樣品準(zhǔn)備2份，以防部分樣品降解時(shí)，還需重新取材、制備或送樣，耽誤寶貴時(shí)間。 5/收樣的細(xì)胞，如無(wú)特殊要求，需保證細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞不能長(zhǎng)的太滿。接觸抑制會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞的翻譯狀態(tài)！ 6/收樣過(guò)程動(dòng)作盡量輕柔且快速，避免樣品反復(fù)凍融。 7/其余樣品類型收樣詳情可聯(lián)系工作人員。 01生物學(xué)重復(fù) 取樣過(guò)程中，為了減少人為造成的樣品間差異，可以采取如下措施：取樣時(shí)間、部位、處理?xiàng)l件、操作過(guò)程等方面盡可能保持一致，否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性和可信度。 02樣品的保存 取樣后，在簡(jiǎn)單處理并標(biāo)記后，-80℃冰箱保存，以避免實(shí)驗(yàn)操作前樣品降解的可能性。 送樣指南 01貼壁細(xì)胞收樣（>1X107） （1）從培養(yǎng)箱中取出貼壁細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞，確定生長(zhǎng)狀態(tài)良好。 （2）待細(xì)胞密度達(dá)70%~80%，加入放線菌酮(CHX, 終濃度為100μg/mL))到培養(yǎng)基阻滯翻譯, 在37℃培養(yǎng)細(xì)胞15分鐘。 （3）胰酶（0.25%）消化后，收細(xì)胞同常規(guī)操作。最后加入預(yù)冷的PBS (0.01M，含100μg/mL CHX)洗三遍后，轉(zhuǎn)至凍存管后離心去上清，置于液氮中速凍 后放于-80℃保存?zhèn)溆谩?/span> 02懸浮細(xì)胞（＞1X107） 03血液樣本 外周血中，外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）在機(jī)體免疫中發(fā)揮了極其重要的作用。將血液中多核細(xì)胞和紅細(xì)胞去除后，可分離出PBMC，從而能夠方便地模擬體外的血液免疫環(huán)境。PBMC的體積、形態(tài)和比重與外周血其他細(xì)胞不同，其比重為1.070左右，而紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞的比重超過(guò)1.080。通過(guò)利用介于兩者比重之間的溶液(分層液或密度梯度分離液)做密度梯度離心，使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，可將各種血細(xì)胞與PBMC分離。具體操作如下： 1. 使用EDTA抗凝管（BD，0202992058）采集6 mL外周血。 2.將新鮮血液轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，室溫2000rpm離心10min。 3. 用1mL移液器小心將上層血清吸出。 4. 將上述已去血清后的血液用生理鹽水按照1:1（體積比）進(jìn)行稀釋，輕輕吹打3-5次混勻。 5. 將Ficoll試劑充分震蕩，上下顛倒5-10次混勻，分裝到15ml離心管中（Ficoll溶液與稀釋后的血液體積比為3:4），豎直放置到水平臺(tái)面上靜止備用。 6. 將稀釋好的血液用移液管緩慢均勻加入到豎直放置在臺(tái)面的含Ficoll溶液的離心管中。（Ficoll溶液與稀釋后的血液體積比為3:4） 7. 將離心管小心緩慢轉(zhuǎn)移至離心機(jī)中，盡量減少晃動(dòng)，保持離心管豎直，以避免打破液面分層。室溫400×g，升降速為1，離心30分鐘。 8. 離心結(jié)束后分4層，由下到上分別為紅細(xì)胞、Ficoll溶液、淋巴細(xì)胞層、生理鹽水。 9. 用移液槍吸取一部分生理鹽水，將槍頭插進(jìn)淋巴細(xì)胞層中小心吸取，轉(zhuǎn)移至新的15mL離心管中。盡量避免吸取到下層或上層的細(xì)胞造成污染。 10. 加入10mL生理鹽水至上述轉(zhuǎn)移出來(lái)的淋巴細(xì)胞中，輕輕吹打混勻，室溫100×g，離心10min 。 11. 棄上清，加入1mL紅細(xì)胞裂解液，裂解3min。室溫300×g，離心5min。 12.棄上清，加入10mL生理鹽水輕輕吹打混勻，室溫100×g，8min離心。重復(fù)2次。 13. 棄上清，用1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入放線菌酮(CHX, 終濃度為100μg/mL))到培養(yǎng)基阻滯翻譯, 在37℃培養(yǎng)細(xì)胞15分鐘。 14. 同時(shí)取樣進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，看細(xì)胞活率、細(xì)胞濃度。 15. 離心收集細(xì)胞后，加入預(yù)冷的PBS (0.01M，含100μg/mL CHX)洗三遍后，轉(zhuǎn)至凍存管后離心去上清，置于液氮中速凍后放于-80℃保存?zhèn)溆谩?/span> 04動(dòng)物組織樣品（＞100mg） 斑馬魚(yú)胚胎 （1）當(dāng)胚胎處于適當(dāng)?shù)碾A段，去除絨毛膜(或手動(dòng)或按標(biāo)準(zhǔn)方案使用pronase)。 （2）室溫下E3培養(yǎng)基清洗2次。 （3）E3培養(yǎng)基中加入放線菌酮(100μg/mL)，室溫下孵育胚胎5分鐘。 （4）用移液器將胚胎轉(zhuǎn)移到冰上的epppendorf試管中。 （5）在液氮中快速冷凍，在-80℃保存。 （6）填寫(xiě)樣本登記單，寫(xiě)明樣本名稱、組織類型、編號(hào)、取樣日期、樣本處理過(guò)程等情況。 哺乳動(dòng)物組織 注意：翻譯是高度動(dòng)態(tài)變化的，對(duì)內(nèi)部和外部信號(hào)都有快速的反應(yīng)。為了準(zhǔn)確測(cè)量整個(gè)組織的體內(nèi)翻譯情況，必須盡快切除并快速冷凍相關(guān)組織，最大限度地減少了核糖體從轉(zhuǎn)錄本上脫落而引起的翻譯變化。 （1）準(zhǔn)備必要的手術(shù)工具，確保操作環(huán)境無(wú)RNase，備好液氮。 （2）按照實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)程序，迅速處死動(dòng)物并摘取目的組織。 （3）用高壓滅菌后的無(wú)RNase PBS清洗組織，去除多余的結(jié)締組織血液。 （4）在液氮中快速冷凍組織，冷凍后碾磨成粉末轉(zhuǎn)移凍存管。 （5）-80度保存，干冰運(yùn)輸。 05植物組織（＞100mg）
（2）待細(xì)胞密度達(dá)70%~80%，加入放線菌酮(CHX, 終濃度為100μg /mL))到培養(yǎng)基阻滯翻譯, 在37℃培養(yǎng)細(xì)胞15分鐘。
（3）離心收集細(xì)胞后，加入預(yù)冷的PBS (0.01M，含100μg/mL CHX)洗三遍后，轉(zhuǎn)至凍存管后離心去上清，置于液氮中速凍后放于-80℃保存?zhèn)溆谩?/span>
（2）立即投入液氮冷凍,冷凍后碾磨成粉末轉(zhuǎn)移凍存管，-80度保存，干冰運(yùn)輸。
